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技術レポート

シンプルステインMAX-PO(M)、シンプルステインAP(M)を用いたマウス第一抗体による三重染色法
試薬
※1 BCIP/NBT基質溶液調整法
●使用時に ii)NBT保存液 6.5μL、iii)BCIP保存液 5μLを混合し,i)100mMトリス塩酸緩衝液1.5mLを加え基質溶液とする。
i )100mMトリス塩酸緩衝液(pH 9.5, 含100mM NaCl, 50mM MgCl2)(冷蔵保存)
(1)  1Mトリス塩酸緩衝液(pH 9.5):Tris(hydroxy-methyl)amino-methane 6.06gを精製水25mLに溶解させ、塩酸にてpHを9.5に調製し、精製水で50mLにメスアップする。
(2) 5M NaCl 水溶液:NaCl 2.93gを精製水10mLに溶解する。
(3) 1M MgCl2 水溶液:MgCl2 3.01gを精製水25mLに溶解する。
(4) (1)(2)(3)を混合し、精製水で500mLにメスアップする。
ii)NBT(Nitro Blue Tetrazolium)保存液(-20℃保存)
・NBT(SIGMA)75mgを70% N,N-ジメチルホルムアミド1mLに撹拌溶解する。
iii)BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphate-5-Toluidine salt)保存液(-20℃保存)
・BCIP(SIGMA)50mgをN,N-ジメチルホルムアミド 1mLに撹拌溶解。
※2 ニューフクシン基質溶液調整法
(2)ニューフクシン溶液、(3)4% 亜硝酸ナトリウム水溶液を100μLずつ等量混合し、1分放置。この液に(4)0.2Mトリス塩酸緩衝液 40mLを加え、さらに撹拌しながら、(1)基質溶液 100μLを溶解する。濾過後すぐに使用する。(用時調整)
i)基質溶液(用時調整)
(1)  naphthol AS-BI phosphoric acid(SIGMA)10mgをN,N-ジメチルホルムアミド100μLに溶解する。
ii)カップラー液
(2)  ニューフクシン溶液:New fuchsin powder(MERCK)4.0gを2N塩酸 100mLに溶解し、濾過する。(冷蔵保存)
(3) 4% 亜硝酸ナトリウム水溶液:亜硝酸ナトリウム 40mgを精製水1mLに溶解する。(用時調整)
iii)0.2Mトリス塩酸緩衝液(pH8.2〜8.3)(常温保存)
(4)  Tris(hydroxy-methyl)amino-methane 12.12gを精製水250mLに溶解し、塩酸にてpHを8.2〜8.3に調製し、精製水で500mLにメスアップする。
※3 DAB基質溶液調整法
下記を溶解、混合、撹拌し、基質溶液とする。(用時調整)
i )3,3'-Diaminobenzidine, tetrahydrochloride(DOJINDO)10mg
ii)0.05Mトリス塩酸緩衝液(pH 7.6,含15mM NaN3)50mL
iii)5% 過酸化水素水 50μL
iv)イミダゾール 34mg
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