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技術レポート

シンプルステインMAX-PO(M)、シンプルステインAP(M)を用いたマウス第一抗体による三重染色法
◆目的:3種類の抗原を同一切片上で検出する。
◆材料:20%緩衝ホルマリン固定・パラフィン包埋切片
◆技術アドバイス(抗原検出の順番の決定)
・1回目の抗原検出は微少抗原や抗原量の少ないものを選択し、BCIP/NBT発色(青色)。
・2回目の抗原検出は細胞質抗原や多量に存在する抗原を選択し、ニューフクシン発色(赤色)。
・3回目の抗原検出は核内抗原や中等量〜多量に存在する抗原を選択し、DAB発色(茶色)。
操作手順
1. 脱パラフィン
 1-1)キシレンに浸す。常温、3分間、3回。
 1-2)エタノールに浸す。100%エタノール:常温、3分間、2回。95%エタノール:常温、3分間、2回。
 1-3)PBSで洗浄する。 常温、3分間、1回。
◆1回目の抗原検出
2. 抗原賦活化処理(1回目の第一抗体の能書に準じ、必要に応じて行う。)
 2-1)1回目の第一抗体の能書に準じた抗原賦活化液および時間にて処理を行う。
 2-2)常温にて20〜60分間自然冷却し、PBSで洗浄する。 常温、3分間、3回。
3. ブロッキング試薬による処理
 3) 10%正常ヤギ血清(ニチレイコード:426041)を滴下する。常温、10分間。
4. 第一抗体の添加・反応(1回目の抗原検出)
 4-1)1回目の第一抗体を滴下する。37℃、1時間。
 4-2)PBSで洗浄する。 常温、3分間、3回。
5. シンプルステインの添加・反応
 5-1)シンプルステイン AP(M)(ニチレイコード:414241)を滴下する。室温、30分間。
 5-2)PBSで洗浄する。 常温、3分間、3回。
 5-3)TBSに置換する。TBS溶液中でスライドを5回上下させる。
6. BCIP/NBT基質溶液※1の添加・反応
 6-1)BCIP/NBT発色。BCIP/NBT基質液を滴下し、検鏡しながら発色する。
 6-2)精製水で洗浄する。
◆2回目の抗原検出
7. 1回目の第一抗体と標識酵素の失活 兼 抗原賦活化処理(2回目の第一抗体の能書に準ずる。)
7-1)(1)または(2)の処理を行う。
(1)2回目の第一抗体が熱による抗原賦活化処理を必要としない場合
 :0.01Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)を耐熱性バットに入れ95℃で10分間加熱する。
(2)2回目の第一抗体が熱による抗原賦活化処理を必要とする場合
 :能書に準じた抗原賦活化液を耐熱性バットに入れ95℃で40分間加熱後、常温にて20分〜60分間自然冷却する。
7-2)PBSで洗浄する。 常温、3分間、3回。
8. ブロッキング試薬による処理
 8)10%正常ヤギ血清(ニチレイコード:426041)を滴下する。 常温、10分間。
9. 第一抗体の添加・反応(2回目の抗原検出)
 9-1)2回目の第一抗体を滴下する。37℃、1時間。
 9-2)PBSで洗浄する。 常温、3分間、3回。
10. シンプルステインの添加・反応
 10-1)シンプルステイン AP(M)(ニチレイコード:414241)を滴下する。常温、30分間。
 10-2)PBSで洗浄する。 常温、3分間、3回。
 10-3)TBSに置換する。TBS溶液中でスライドを5回上下させる。
11. ニューフクシン基質溶液※2の添加・反応
   11-1) ニューフクシン発色。ニューフクシン基質溶液を滴下し、検鏡しながら発色する。
(ニューフクシン基質キット(ニチレイコード:415161)も使用できます。)
11-2) 精製水で洗浄する。
◆3回目の抗原検出
12. 2回目の第一抗体と標識酵素の失活 兼 抗原賦活化処理(3回目の第一抗体の能書に準ずる。)
12-1)(1)または(2)の処理を行う。
(1)3回目の第一抗体が熱による抗原賦活化処理を必要としない場合
 :0.01Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)を耐熱性バットに入れ95℃で10分間加熱する。
(2)3回目の第一抗体が熱による抗原賦活化処理を必要とする場合
 :能書に準じた抗原賦活化液を耐熱性バットに入れ95℃で40分間加熱後、常温にて20分〜60分間自然冷却する。
12-2)PBSで洗浄する。 常温、3分間、3回。
13. 内因性ペルオキシダーゼ除去
 13-1)3%過酸化水素水に浸す。常温、10分間。
 13-2)PBSで洗浄する。 常温、3分間、3回。
14. ブロッキング試薬による処理
 14)10%正常ヤギ血清(ニチレイコード:426041)を滴下する。常温、10分間。
15. 第一抗体の添加・反応(3回目の抗原検出)
 15-1)3回目の第一抗体を滴下する。37℃、1時間。
 15-2)PBSで洗浄する。 常温、3分間、3回。
16. シンプルステインの添加・反応
 16-1)シンプルステイン MAX-PO(M)(ニチレイコード:424131)を滴下する。常温、30分間。
 16-2)PBSで洗浄する。 常温、3分間、3回。
17. DAB基質溶液※3の添加・反応
   17-1) DAB発色。DAB基質溶液を滴下し、検鏡しながら発色する。(シンプルステインDAB溶液(ニチレイコード:415171)
またはDAB基質キット(ニチレイコード:425011)も使用できます。)
17-2) 精製水で洗浄する。
18. 封入
   18) 水溶性封入剤で封入する。(水溶性永久封入剤(ニチレイコード:415131)またはグリセロールビニルアルコール(ニチレイコード:415031)も使用できます。)
◆参考
1回目の第一抗体の反応時間を4℃、一晩とし、2回目、3回目の第一抗体の反応時間を37℃、1時間とした場合、本操作全てを2日間で行うことができます。
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